Vijay Prajapati

𝗡𝗲𝘄 𝗽𝗮𝗽𝗲𝗿 𝗶𝗻 𝗽𝗿𝗲𝘀𝘀 𝗶𝗻 𝗣𝗔𝗥𝗔𝗦𝗜𝗧𝗘 (𝘄𝗶𝗹𝗹 𝗯𝗲 𝗽𝘂𝗯𝗹𝗶𝘀𝗵𝗲𝗱 𝗶𝗻 𝟮𝟬𝟮𝟱): Apoptotic proteins in Leishmania donovani: in silico screening, modeling, and validation by knock-out and gene expression analysis 🔜parasite-journal.org/ Abstract: Visceral leishmaniasis, a life-threatening vector-borne illness that disproportionately affects children and elderly immunocompromised people, is a primary tropical neglected disease. No apoptotic partner proteins have yet been reported in Leishmania donovani, while their identification could contribute to knowledge on parasite cell death and the establishment of alternative therapeutics. We searched for the mammalian Bcl-2 family protein orthologs and found one anti-apoptotic and two pro-apoptotic, in L. donovani. A Pro-death aquaporin protein, due to its characteristic BH3 domain, which is known to interact with pro-apoptotic proteins in mammalian Bcl-2 family proteins was also included in this study. Molecular docking and molecular dynamics simulations were conducted to assess the protein-protein interactions between the identified apoptotic proteins and mimic mammalian intrinsic apoptotic pathways. The results showed that both pro-apoptotic proteins interacted with the hydrophobic pocket of the anti-apoptotic ortholog, forming a stable complex, which may represent a critical event in the apoptotic pathways of leishmaniasis. To further characterise an apoptotic pathway in L. donovani, we used CRISPR-Cas9 approaches to target the identified proteins. The pure knocked population mutants and episomal over-expressing mutant cells were exposed to apoptotic stimuli. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay and quantitative expression profiling suggested that these proteins are involved in the parasite’s apoptosis and could play a role in parasite survival. Résumé Protéines apoptotiques chez Leishmania donovani : criblage in silico, modélisation et validation par knock-out et analyse de l'expression génique La leishmaniose viscérale, une maladie à transmission vectorielle potentiellement mortelle qui touche de manière disproportionnée les enfants et les personnes âgées immunodéprimées, est une maladie tropicale primaire négligée. Aucune protéine partenaire apoptotique chez Leishmania donovani n'a encore été signalée, alors que leur identification pourrait contribuer à la connaissance de la mort cellulaire du parasite et à l'établissement de thérapies alternatives. Nous avons recherché les orthologues des protéines de la famille Bcl-2 des mammifères et avons trouvé un anti-apoptotique et deux pro-apoptotiques chez L. donovani. Une protéine aquaporine pro-mort, en raison de son domaine BH3 caractéristique qui est connu pour interagir avec les protéines pro-apoptotiques des protéines de la famille Bcl-2 des mammifères, a également été incluse dans cette étude. Des simulations d'amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire ont été réalisées pour évaluer les interactions protéine-protéine entre les protéines apoptotiques identifiées et imiter les voies apoptotiques intrinsèques des mammifères. Les résultats ont montré que les deux protéines pro-apoptotiques interagissaient avec la poche hydrophobe de l'orthologue anti-apoptotique, formant un complexe stable, qui pourrait représenter un événement critique dans les voies apoptotiques de la leishmaniose. Pour caractériser davantage une voie apoptotique chez L. donovani, nous avons utilisé des approches CRISPR-Cas9 pour cibler les protéines identifiées. Les mutants de population « knocked out » purs et les cellules mutantes surexprimant les épisomes ont été exposés à des stimuli apoptotiques. Le test de marquage des extrémités de l'ADN par la désoxynucléotidyltransférase terminale dUTP (TUNEL) et le profilage d'expression quantitatif ont suggéré que ces protéines sont impliquées dans l'apoptose du parasite et pourraient jouer un rôle dans sa survie.